开发不依赖于亚硫酸氢盐RNA m⁵C单碱基测序检测方法

RNA 5-甲基胞嘧啶修饰作为一种重要的转录后修饰，广泛分布于rRNA、tRNA和mRNA上，对基因表达调控具有重要影响。

传统的m5C检测方法主要依赖于亚硫酸氢盐测序，该方法虽然能实现单碱基分辨率的m5C修饰定量检测，但存在诸多不足，如间接检测导致的假阳性、反应条件苛刻引发的RNA降解，以及序列复杂度降低影响比对准确度等。

m5C-TAC-seq技术的核心原理是将酶促反应与化学标记相结合，利用优化后的TET酶促反应将RNA m5C氧化至f5C，并进一步使用叠氮茚二酮对氧化产生的f5C进行特异性标记。

标记产物不仅能产生C-to-T的转变，还可以通过点击化学反应进行富集，从而实现m5C修饰的单碱基分辨率直接检测。这一技术能够灵敏地检测修饰比例低至2.5%的位点，且具有反应条件温和、不影响转录组碱基组成的特点，因此适用于低丰度和低序列复杂度的转录本。

m5C-TAC-seq技术还结合了multiplexing文库构建策略，减少了样品之间的技术误差，并实现了m5C修饰的半定量检测。

研究人员利用该技术绘制了HeLa、HEK293T和mESC的单碱基分辨率m5C修饰图谱，验证了其高灵敏度和高精度。这一新技术的开发为全面理解RNA m5C修饰的生物学功能提供了强有力的工具，并有望推动相关领域的深入研究。